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流式细胞术,获得完美DNA细胞周期的关键点
2018-03-13    来源:ZSCI公众号

获得完美DNA细胞周期的关键点

DNA 细胞周期是流式细胞术非常重要的技术,它看似容易。但实际上为了获得正确的分析结果,需要记住若干关键点。

 

▼ 获得足够的事件

细胞周期分析需要用某个数学模型拟合数据,这些模型对S期、G1、G2/M 期进行了不同的假设性推算,因此,需要有足够多的数据供模型拟合。

为了获得足够的数据,从G1峰开始到G2/M峰末尾之间的每个channel均需获取到100个事件,也就是说,假如G1峰的起始处位于40000道,G2/M峰末尾位于110000道,那么应获取的事件数量应该是(110000-40000)×100=700 万个事件。

 

▼记得化学计量学

DNA 染料的浓度需要足量,以使其能够与细胞内的DNA 含量成正确的比例结合。因此在染色前应该进行精确的细胞计数,并确保加入正确量的DNA 染料。

 

▼固定很重要

交联类试剂(例如甲醛)可减少染料结合,因为它们可诱导染色质交联。脱水类固定剂(例如甲醇和乙醇)更好,但高浓度亦会造成细胞成团,并且脱水类固定剂会影响表面荧光染料。别忘了,少量去污剂可帮助改善DNA染料的结合。

 

▼别忘记使用RNAase

一些染料(例如PI)会同时结合DNA 和RNA,如果使用PI,必须在染色缓冲液中加入RNAse。如果不这么做,会导致DNA直方图很差。

 

▼控制细胞周期

建议在所有的实验中均加入一个DNA 细胞周期质控品,这样可以更好地确定细胞周期的改变,允许你比较不同样本/ 机器/ 日期之间的结果,以提高可重复性和可信度。最常用的质控品是鸡红细胞和鲑鱼红细胞。

总之,细胞周期是流式细胞术中非常重要的工具,但其中还是有不少需要优化的步骤,不要认为在样本中加入一些PI 就能够得到好的DNA 直方图。选择最好的固定剂、正确的染料、良好的仪器都对DNA 细胞周期非常重要。


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