当小编第一次学习无缝克隆时，第一反应是天那，这么高端大气的实验技术！不但可以完全替代双酶切连接的载体构建技术，15分钟搞定载体构建，还可以进行多片段定向重组、高通量载体构建和载体改造！

太符合这个时代对于实验技术简便、快速的要求了！让我们赶快学起来！

看完以下几张图，原来无缝克隆猴塞雷！超Easy！

Step 1 载体的线性化 

先确定片段的克隆位点，质粒是否是表达载体？如果是一般会将基因克隆进入载体的转录起始信号和终止信号之间。当然这个位置也是多克隆位点的所在地，这样就简单了，我们在多克隆位点处选1-2个酶切位点就可以进行载体线性化啦！（当然如果没有酶切位点，也可以通过PCR在克隆位点两侧进行载体的线性化。）

Step2无缝克隆引物设计

怎么在引物中加入重叠序列？首先找到多克隆位点序列，一般的质粒图谱都会提供，再找到我们线性化质粒时所选的酶切位点。在正义链第一个酶切位点上游（5’端）数出10个碱基，在第二个酶切位点互补序列的上游（5’端）数出10个碱基，再分别加上两个酶切位点序列，这就是与载体重叠的部分。将这两段重叠序列分别加到扩增插入DNA的上下游特异引物5’端即获得了无缝克隆的引物。So Easy！导师再也不用担心我的学习了！

Step3无缝重组

看！用这对引物扩增出来的DNA片段两端会带有线性载体的重叠序列。这时就可以将DNA片段与线性载体进行无缝重组啦！

仅仅15分钟，质粒就已经构建好啦！看，两个酶切位点就在那里，不增不减，还可以被我们再次利用。新技能get!