当小编第一次学习无缝克隆时,第一反应是天那,这么高端大气的实验技术!不但可以完全替代双酶切连接的载体构建技术,15分钟搞定载体构建,还可以进行多片段定向重组、高通量载体构建和载体改造!
太符合这个时代对于实验技术简便、快速的要求了!让我们赶快学起来!
看完以下几张图,原来无缝克隆猴塞雷!超Easy!
Step 1 载体的线性化
先确定片段的克隆位点,质粒是否是表达载体?如果是一般会将基因克隆进入载体的转录起始信号和终止信号之间。当然这个位置也是多克隆位点的所在地,这样就简单了,我们在多克隆位点处选1-2个酶切位点就可以进行载体线性化啦!(当然如果没有酶切位点,也可以通过PCR在克隆位点两侧进行载体的线性化。)
Step2无缝克隆引物设计
怎么在引物中加入重叠序列?首先找到多克隆位点序列,一般的质粒图谱都会提供,再找到我们线性化质粒时所选的酶切位点。在正义链第一个酶切位点上游(5’端)数出10个碱基,在第二个酶切位点互补序列的上游(5’端)数出10个碱基,再分别加上两个酶切位点序列,这就是与载体重叠的部分。将这两段重叠序列分别加到扩增插入DNA的上下游特异引物5’端即获得了无缝克隆的引物。So Easy!导师再也不用担心我的学习了!
Step3无缝重组
看!用这对引物扩增出来的DNA片段两端会带有线性载体的重叠序列。这时就可以将DNA片段与线性载体进行无缝重组啦!
仅仅15分钟,质粒就已经构建好啦!看,两个酶切位点就在那里,不增不减,还可以被我们再次利用。新技能get!