Western Blot做的顺利的时候很简单，可不顺的时候也很令人心烦，比如：

做不出结果、假阳性、结果出现多条带、一抗/二抗谁有问题傻傻分不清楚……

怎么办？

其实，作为有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。

良好的参照体系通常包括：

分子量marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)；

空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)；

已知量标准产物的正对照；

内参。

今天就跟大家一起谈谈内参选择的重要性和注意事项～

1. 内参的重要性：

内参即是内部参照(Internal Control)，对于小伙伴们研究的比较多的哺乳动物细胞，我们内参一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

在Western Blot实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

2. 如何选择合适的细胞核内参抗体？

常用的细胞总蛋白质内参：

GAPDH和细胞骨架蛋白β-Actin或β-Tubulin等；

对于一些植物的样本，则需要特别的植物Actin蛋白作为内参；

当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用：

组蛋白H（Histone H）或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。

其它常见的核蛋白内参：K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。

但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。

 另外，小伙伴们还需要根据目的蛋白的大小选择合适的核内参，翠花推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。

3. 各内参蛋白大小：

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在37kDa；

beta-actin大约在42kDa;

beta-tubulin检测条带在55kDa左右，该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中;

PCNA的检测分子量大约在28kDa，而Histone H3的检测条带大约在18kDa，因此PCNA比较适合用于检测目标蛋白在较大的WB实验，而Histone H3则不适合用于13kD-23kD大小的目的蛋白内参。另外，虽然PCNA是最合适的核内参抗体之一，但是在某些条件下，一些影响增殖的因素会导致样品间PCNA含量的变化，就不适合作为内参。

4. 内参WB图举例：

Migliaccio et al. B-cell receptor-guided delivery of peptide-siRNA complex for B-cell lymphoma therapy. Cancer Cell International (2015) 15:50