▼ 传代前准备： 

1. 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2. 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 

3. 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 

4. 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 

▼ 细胞传代：

1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 

6. 弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。

7. 将细胞悬液吸入10 ml离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 

8. 弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

9. 将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

10. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×10⁵/ml。最后要做好标记。 

11. 继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO₂培养箱中继续培养。传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。

注意事项： 

1.严格的无菌操作 

2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

2.细胞冻存具体操作