尽管上百种环状RNA（circular RNA, circRNA）在哺乳动物大脑中大量存在，但是一个重要的问题仍未解决：它们实际上发挥着什么作用？在一项新的研究中，来自德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心的Nikolaus Rajewsky和他的团队首次将一种circRNA与大脑功能关联在一起。相关研究结果于2017年8月10日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function”。

RNA远不仅是DNA和它编码的蛋白之间的普通信使。确实，存在几种不同的非编码RNA分子。它们能够是长链非编码RNA（lncRNA）或短调节RNA（miRNA）；它们能够干扰蛋白产生（siRNA）或者协助蛋白产生（tRNA）。在过去20年里，科学家们已发现了大约20种在分子微观世界中形成复杂网络结构的RNA种类。在它们当中最为神秘的是circRNA，它们是一类不同寻常的RNA，这是因为它们的头部与它们的尾部连接在一起，形成一种共价闭合环。几十年来，circRNA被认为是一种罕见的外来的RNA种类。事实上，情况刚好相反。当前的RNA测序分析已揭示出它们是一种庞大的RNA种类，在大脑组织中高度表达。

上千种circRNA存在于线虫、小鼠和人类中：

在2013年，两项发表在Nature期刊上的开创性研究描述了circRNA，其中的一项研究是由Nikolaus Rajewsky和他的团队领导的。有趣的是，大多数circRNA是非常稳定的，在细胞质中连续地漂浮几个小时甚至几天。Rajewsky团队提出circRNA至少有时发挥着基因调节的作用。作为一种较大的单链环状RNA，Cdr1as有大约1500个核苷酸，可能发挥着像海绵那样吸收微RNA（microRNA, miRNA）的作用。比如，它为一种被称作miR-7的microRNA提供70多个结合位点。microRNA是较短的RNA分子，通常结合到信使RNA（mRNA）的互补序列上，因而控制着细胞产生的特定蛋白数量。

此外，Rajewsky和他的合作者们分析了相关数据库，发现了线虫、小鼠和人类中的上千种不同的circRNA。它们中的大多数在进化中是高度保守的。Rajewsky说，“我们发现了一个平行的未知RNA世界。自从首次发表以来，这个领域已取得极大发展；上百项新的研究已被开展。”

理解一种主要在兴奋性神经元中存在的circRNA：

在当前的这项研究中，Rajewsky团队与马克斯-德尔布吕克分子医学中心的Carmen Birchmeier实验室合作重新研究了Cdr1as。论文共同第一作者Monika Piwecka说，“这种特定的circRNA能够在兴奋性神经元中但不在神经胶质细胞中发现。在小鼠和人类的大脑组织中，存在两种结合到它上的microRNA：miR-7和miR-671。”

接下来，Rajewsky和他的合作者们利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9选择性地剔除小鼠中的一种环状RNA，即Cdr1as。在这些小鼠中，大多数microRNA的表达在4个研究的大脑区域中未被干扰。然而，miR-7下调表达，miR-671上调表达。这些变化是转录后发生的，这就与Cdr1as通常与细胞质中的这些microRNA相互作用的观点相一致。

Rajewsky说：“这表明Cdr1as通常通过吸收miR-7而让它保持稳定或运送它，而miR-167可能起着调节这种特定circRNA水平的作用。”如果miR-7在细胞中漂浮着，不能够结合任何地方，那么它将作为废弃物被降解。这种circRNA阻止这种情形发生，也将它携带到新的地方，如突触。他补充道，“我们可能不应将Cdr1as比作为海绵，而应将它比作为船。它阻止它的乘客溺水，同时也将它们带到新的码头。”

microRNA浓度变化对神经细胞中的mRNA和它们表达的蛋白产生显著的影响，特别是对一组被称作“立即早期基因（immediate early genes）”的基因而言。这些变化是神经元遭受刺激时作出第一波反应的一部分。编码涉及维持小鼠醒睡周期（sleep-wake cycle）的蛋白的mRNA也受到影响。

Cdr1as调节突触反应：

利用单细胞电生理学技术，论文共同作者、柏林夏里特医学院研究员Christian Rosenmund观察到突触中的自发性囊泡释放增加了两倍。对两个连续刺激作出的突触反应也发生变化。进一步在马克斯-德尔布吕克分子医学中心开展的行为分析反映了这些发现。尽管这些小鼠在很多方面表现正常，但是它们不能够降低它们对噪声等外来信号作出的反应。在精神分裂症或其他的精神疾病患者中，也注意到前脉冲抑制（pre-pulse inhibition）发生了类似的破坏。 

我们每天的经历依赖于这种噪声过滤功能：当强烈的噪声突然地破坏图书馆的安静气氛时，我们很难避免不受伤害。然而，这种相同的突然巨响将对附近的建设工地似乎没有那么大的威胁。在这种情形下，大脑有机会加工之前发生的噪音，过滤到不必要的信息。因此，惊跳反射（startle reflex）受到抑制，即前脉冲抑制。这种基础的大脑功能允许健康的动物和人类短暂地适应强刺激，避免信息超负荷。如今，这些研究人员发现这种功能与Cdr1as存在关联。

Nikolaus Rajewsky说：“从功能上说，我们的数据提示着Cdr1as和它与microRNA之间发生的直接相互作用对感觉运动门控（sensorimotor gating）和突触传递是较为重要的。一般地说，鉴于大脑发生非常高的多样化的环状RNA表达，我们认为我们的数据提示着这些环状RNA发挥着一种之前未知的生物学功能。”

如何激光显微切割样品获取完整RNA？

从异质性样本中获取特定的细胞群是特定细胞类型基因表达谱研究中面临的主要挑战。激光捕获显微切割 (LCM) 是由NIH和Arcturus, Inc.合作开发的，专用于从正常组织中分离癌症细胞，可以采用该方法从复杂组织和器官中分析单个细胞类型。 随后从显微切片中提取RNA，用于基因表达分析。

LCM的工作原理

LCM可以从薄组织切片中选择并捕获细胞或者不同的形态结构。 通过固定、染色和脱水制备OCT包埋冰冻组织切片，用于LCM过程。 然后通过粘附在微量离心管盖底部的热塑薄膜显示切片。 激光脉冲穿过薄膜直接射在靶细胞上。 目标区域上的塑料薄膜被熔化，随后冷却并与下层的细胞结合。 然后收集薄膜连同其粘附的靶细胞。 从上述捕获的细胞中分离RNA，用于实时荧光定量RT-PCR和mRNA表达图谱分析。

下面我们为你们提供一些建议，避免缺陷并可以从LCM样本中获取高品质RNA。

冷冻并包埋组织

冷冻样本以迅速保存RNA至关重要。 我们一般使用组织冷冻喷雾，如Cytocool II (Richard Allen Scientific) 瞬间冻结样本，但亦可使用液氮。

 尽管未包埋冷冻组织也可用于冰冻切片，但我们推荐使用冷冻包埋基质 (如TissueTek O.C.T.) 包埋样本，有助于在切片过程中保存形态学特征。

在包埋组织时使样本保持冷却；使用一次性乙烯样品包埋模具在干冰上包埋冷冻组织。

冰冻切片组织

用RNaseZap® 清洁样品台，并涂上一层O.C.T.，将组织置于台上。 将样品台置于干冰内，在处理前使O.C.T.冷冻。 这层额外的包埋剂有助于防止在冰冻切片过程中，切刀将组织从台面上碰掉。

确保在冰冻切片前，将包埋组织平衡至冷冻台的温度。 最佳切割温度为–10至–60°C，具体取决于组织的脂肪含量。

在切片过程中使组织保持冷却，以免RNA降解。 如果在此过程中组织温度升高，则喷洒组织冷冻喷雾，快速冷却组织或仪器。

 将显微镜载玻片盒置于干冰上，立即将切片的载玻片置于预冷的盒内。 如果在切片后立即进行染色，则更方便的做法是在开始染色前，先将其保存在低温恒温器内。

冷冻切片的玻片可以安全地冷冻，以供稍后使用。 在载玻片盒中加入一小包干燥剂 (吸附剂)，以实验薄膜密封，置于–80ºC下储存待染色。

玻片固定并染色

为避免将残留的乙醇带到下一步骤，在吸附剂表面轻轻拍打玻片，去除多余的乙醇。

使用分子筛 (如EMD化学分子筛，4A型，8–12目微珠) 用于100%乙醇，减少水分积聚。

确保冰冻切片样本充分脱水

在开始LCM前，使样本充分脱水至关重要。 潮湿样本易受静水压力作用，LCM后难以从载玻片和周围组织中分离目标组织。 脱水不充分的样本一般半透明度更高，且表面更亮。

经常更换乙醇和二甲苯固定液。

如果您脱水时间较短时，脱水不充分，可以将乙醇/水溶液处理的时间延长至30秒，将100%乙醇处理的时间延长至1分钟。

增加10秒的二甲苯处理步骤，然后在脱水后利用二甲苯去除乙醇5分钟。

高湿度会对LCM实验产生严重影响。 如果在您设置过程中存在湿度问题，则使用湿度计监测室内湿度，并采用除湿器将环境湿度保持在25–45%范围内。

进行LCM并开始RNA提取步骤

载玻片固定并染色后，应立即进行LCM，将RNA降解程度降至最低。

使用胶条去除载玻片上的疏松组织，然后进行LCM。

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